PROYECTO: ESTRÉS OXIDATIVO

El proyecto de investigación en Medicina Biológica Veterinaria desarrollado junto con la Dra. Laura Meneses tiene como objetivo analizar el nivel de estrés oxidativo en caninos clínicamente sanos y enfermos de la Ciudad de Buenos Aires. Articula el trabajo de distintas universidades nacionales mediante la utilización de tecnología de medición de toxicidad provista por el Dr. Alejandro Mazzarini. Los cambios moleculares que ocurren en el estrés oxidativo ocasionan efectos dañinos sobre los sistemas biológicos. En el estrés oxidativo se producen radicales libres en exceso que pueden causar daño celular en lípidos, proteínas y ADN, inhibiendo su normal funcionamiento. Estos cambios se originan antes de que aparezcan los síntomas clínicos de enfermedad.

Los radicales libres tienen un rol importante en las enfermedades crónicas y en el proceso de envejecimiento. Conocer el estrés oxidativo nos permite implementar medidas preventivas y terapéuticas para el cáncer, la artrosis, enfermedades cardiovasculares y autoinmunes, entre otras.

Título del Proyecto:
“Determinación de estrés oxidativo en caninos clínicamente sanos y enfermos y estudio comparativo de dos métodos analíticos”.

Integrantes:
M.V. Julia Lavalle
Dra. María Laura Meneses

Resumen:
El delicado equilibrio entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de los radicales libres es un aspecto muy importante de los organismos vivos y se logra por mecanismos llamados "regulación redox”, apócope de reducción-oxidación. El disbalance entre sustancias prooxidantes y antioxidantes a favor de prooxidantes se denomina estrés oxidativo, y tiene efectos dañinos en los sistemas biológicos. Los excesos de especies reactivas de oxígeno (EROs) pueden causar daño celular en lípidos, proteínas o ADN provocando la inhibición de su función normal.

En medicina veterinaria existen muchos estudios sobre estrés oxidativo fundamentalmente en animales de producción (Castillo y col. 2005; Lykkesfeldt, J y Svendsen, O. 2007; Sordillo y Aitken, 2009)^1,2,3. Los estudios que se observan en animales de compañía suelen estar enfocados a la medición de la capacidad oxidante y antioxidante en cáncer, como ser linfoma, para evaluar el costo-beneficio de la quimioterapia (Winter y col., 2009; Bottari y col. 2015;)^4,5.

En la actualidad, en la práctica clínica de nuestra región, se utiliza para medir el nivel de estrés oxidativo el método de tipo cualitativo conocido  como CMR (Capacidad Metabólica Residual). El inconveniente que surge, es que las metodologías existentes para la medición cuantitativa son poco accesibles y complejas. En cambio el método de CMR es de fácil ejecución y realizable en consultorio. Nuestro objetivo consiste en comparar el método CMR con el método para la determinación de la peroxidación lipídica desarrollado en suero humano por Estepa, V. y col. (2001).⁶, para estandarizarlo y validarlo en caninos. Se analizarán  sueros de perros clínicamente sanos con estas dos metodologías, en simultáneo y con un fin comparativo; y se determinará la capacidad antioxidante sérica midiendo niveles de vitamina E, vitamina C y vitamina B12 cianocobalamina.

Marco teórico:
En el año 1954, la doctora argentina Gershman y sus colaboradores fueron los primeros en describir la “teoría de los radicales libres”, quienes indicaron que las formas parcialmente reducidas del oxígeno eran tóxicas en sistemas biológicos (Gershman y col., 1954)⁷. Posteriormente, Denham Harman en 1956 propuso el concepto sobre el cual los radicales libres juegan un rol en el proceso de envejecimiento (Harman, 1956)⁸. En 1969, McCord y Fridovich descubrieron la enzima superóxido dismutasa (SOD) y proporcionaron evidencia convincente sobre la importancia de los radicales libres en sistemas biológicos (McCord y Fridovich, 1969)⁹. Asimismo en 1977, Mittal y Murad presentaron pruebas de que el radical hidroxilo (OH) junto con la enzima SOD estimulan la activación de la guanilato ciclasa y la formación del "segundo mensajero" monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) (Mittal y Murad, 1977)¹⁰.

En la actualidad, se sabe que los radicales libres de oxígeno o, más en general, las especies reactivas de oxígeno (EROs), así como especies reactivas de nitrógeno (ERNs), son productos del metabolismo celular normal. EROs y ERNs son bien conocidos por jugar un papel dual, ya que pueden ser perjudiciales o beneficiosos para los sistemas vivos (Valko y col, 2006)¹¹. Los efectos beneficiosos de ROS se producen a concentraciones bajas / moderadas e implican roles fisiológicos en las respuestas celulares a noxas, como ser en la defensa contra agentes infecciosos y en la función de sistemas de señalización celular. Un ejemplo beneficioso adicional de EROs en concentraciones bajas / moderadas es la inducción de una respuesta mitogénica.

El efecto dañino de los radicales libres en sistemas biológicos se denomina estrés oxidativo y estrés nitrosativo (Kovacic y Jacintho, 2001; Ridnour y col., 2005; Valko y col., 2001)^12,13,14. Esto ocurre en los sistemas biológicos cuando hay una sobreproducción de EROs / ERNs por un lado y una deficiencia de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos por el otro.

Los excesos de EROs pueden causar daño celular en lípidos, proteínas o ADN provocando la inhibición de su función normal. Debido a esto, el estrés oxidativo ha sido implicado en una serie de enfermedades del ser humano, así como también en el proceso de envejecimiento. El delicado equilibrio entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de los radicales libres es un aspecto muy importante de los organismos vivos y se logra por mecanismos llamados "regulación redox”, apocope de reducción-oxidación.
Como citan Pérez Gastell y Pérez de Alejo se puede medir este tipo de daño mediante métodos directos e indirectos. Entre los primeros tenemos la medición de la concentración de agentes oxidantes, que es muy difícil por su corta vida media y lo costoso que resultan los equipos, lo que hace imprescindible medirlos indirectamente mediante:

Determinación de productos terminales de la acción oxidante sobre biomoléculas: los métodos para medir peróxidos lipídicos son el patrón de oro.

Medición de la concentración de antioxidantes: los resultados de diferentes estudios muestran que los niveles de antioxidantes pueden disminuir o aumentar en muchas enfermedades, por lo que al monitorearlos pueden ser utilizados como marcadores de enfermedad o para el seguimiento terapéutico.

Medición del estado antioxidante total: este método refleja el balance dinámico entre el sistema antioxidante y los prooxidantes (Pérez Gastell y Pérez de Alejo, 2000)¹⁵.

En medicina veterinaria existen muchos estudios sobre estrés oxidativo fundamentalmente en animales de producción (Castillo y col. 2005; Lykkesfeldt, J y Svendsen, O. 2007; Sordillo y Aitken, 2009 )^1,2,3 . Los estudios que se observan en animales de compañía suelen estar enfocados a la medición de la capacidad oxidante y antioxidante en cáncer, como ser linfoma, para evaluar el costo-beneficio de la quimioterapia (Winter y col., 2009; Bottari y col. 2015;)^4.5.

En la actualidad, en la práctica clínica de nuestra región, no se usan métodos cuantitativos como ser la determinación de productos terminales de la acción oxidante sobre biomoléculas, por carecer de pruebas estandarizadas. Sin embargo, es conocido el uso de la prueba físico-química de tipo cualitativa para medición de la capacidad metábolica residual (CMR) que deriva de la oxidación fotobiológica. Esta técnica, utilizada en el Instituto de Medicina Evolutiva y Biologica de la Ciudad de Rio Cuarto (Cordoba), consiste en exponer la sangre del paciente al H₂O₂ y junto con la activación electrolítica y luz ultravioleta se produce la liberación de sustancias intracelulares. El resultado de la liberación de los radicales libres, propios de la muestra y de los añadidos, en combinación con los antioxidantes genera una reacción físico-química compleja con la formación de un sobrenadante espumoso de color y volumen variable.  Nuestro objetivo es determinar el nivel de estrés oxidativo y la capacidad antioxidante en sueros caninos, estandarizar y validar el método para la determinación de la peroxidación lipídica desarrollado en suero humano por Estepa, V. y col. (2001)⁶. Posteriormente se analizaran sueros de caninos clínicamente sanos con los dos tipos de métodos descriptos en simultáneo con un fin comparativo. Y se medirán la capacidad antioxidante a través de los niveles de vitamina E, vitamina C y vitamina B12cianocobalamina. Es sabido que la peroxidación lipídica como único método no debe ser utilizada como criterio universal, la evaluación del "estado oxidativo" de un individuo puede requerir una combinación de métodos, cada uno representando diferentes tipos de "estrés oxidativo" (Dotan y col. 2004)¹⁶. Sin embargo, en nuestra región este trabajo puede considerarse como el inicio de indicadores que evalúen distintos niveles de estrés oxidativo y que posterior e inevitablemente traiga aparejado la necesidad de poner a punto el resto de los métodos que describe la comunidad científica.

Objetivo Principal:
-Determinar el nivel de estrés oxidativo y la capacidad antioxidante en la población canina sana; estandarizar y validar el método MDA-TBA.

Objetivos Secundarios:

- Determinar la capacidad antioxidante de la población canina sana.
- Estandarizar y validar la técnica analítica MDA-TBA por espectofotometría.
- Analizar el nivel de estrés oxidativo por los métodos de CMR.
- Comparar los resultados obtenidos con los métodos CMR y MDA-TBA.
- Analizar los niveles de vitamina E, vitamina C y vitamina B12.
- Realizar el análisis epidemiológico de las pruebas diagnósticas.

Materiales y Métodos
Se estudiaran la población canina de la ciudad de Buenos Aires. Se obtendrán 5cc de sangre de 150 perros clínicamente sanos y se efectuara la medición de estrés oxidativo.

Para determinar la capacidad oxidante se utilizara el método MDA-TBA y CMR, y para determinar la capacidad antioxidante se medirá vitamina E, vitamina C y vitamina B12 cianocobalamina. La determinación  de estrés oxidativo con el método CMR se efectuará en consultorio.  La prueba MDA- TBA y  la medición de  vitamina E, vitamina C y vitamina B12, en laboratorio estándar.

A.1) Puesta a punto del método analítico MDA-TBA por espectofotometría:

Materiales:

- Espectofotómetro
- Pipetas automáticas 200 ul
- Tips
- Portatips
- Centrífuga
- Agua destilada
- Tubos de ensayo 10 ml con tapón
- Gradillas
- Tubos ependorf
- Pipetas de 10 ml
- Propipetas
- Baño María
- Máquina de hielo

Reactivos:

- Reactivo cromógeno de ácido tiobarbitúrico (TBA): disolución de 5 g/L de ácido tiobarbitúrico (4,6- dihidroxipirimidina-2-tiol) en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,3% (V/V) en agua destilada.
- Reactivo antioxidante: disolución de 2,2 g/L de butil-hidroxi-tolueno (BHT) en etanol.
- Disolución tampón de HCl-glicocola a pH=3,5: disolver 75,05 g de glicocola y 58,44 g de NaCl en 900 mL de agua destilada, ajustar a pH 3,5 con hidróxido de sodio 0,1 M y completar a 1000 mL con agua destilada.
- Reactivo catalizador: disolución de 2,7 g/L de tricloruro de hierro(III) FeCl 3 .6H 2 O, en agua destilada.
- Patrón de malondialdehído: disolución al 20% (V/V) de 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) en disolución tampón a pH = 3,5, con la adición de 400 μL de HCl 1N con el fin de favorecer la hidrólisis del producto.

Metodología:

En tubos de ensayo de 10 mL de capacidad, se añaden respectivamente 100 μL de suero (muestras problema), 100 μL de H 2 O destilada (muestra blanco), 100 μL de disolución patrón (muestras patrón) y a continuación los siguientes reactivos en el orden que se describe:

1) 0,1 mL de reactivo antioxidante
2) 0,1 mL de reactivo catalizador
3) 1,5 mL de disolución tampón

Esta mezcla de reacción se mantiene 60 minutos a 5°C. Transcurrido este tiempo, se lleva a ebullición en un baño de agua a una temperatura entre 95°C y 100°C durante 60 minutos, para desarrollar la máxima coloración en todas las muestras y patrones. Los tubos se tapan para evitar pérdidas de líquido por evaporación.

Una vez verificada la reacción, se procede a la extracción de los aductos con una disolución mezcla de 2,5 mL de una disolución de n-butanol-piridina (15:1 V/V) y 0,5 mL de agua destilada, enfriando previamente los tubos en un baño de hielo.

Tras mezclar y centrifugar a 4000 r.p.m. durante 10 minutos, las capas superiores o sobrenadantes se recogen en un tubo limpio y se procede a la lectura de las absorbancias a 532 nm, frente a un blanco de reactivos.

A.2) Prueba de CMR (Capacidad Metabólica Residual):

Materiales:

- Jeringa de 5 cc
- Aguja 25 x 8
- Alcohol 70 %
- Solución fisiológica
- Peróxido de hidrógeno al 3%
- Peróxido de hidrógeno al 10%
- Vaso de precipitado de 25 ml
- Tubo de hemólisis con citrato de sodio al 3,8 %
- Hemoactivador

Técnica:

- Se extraen 3 ml de sangre venosa periférica.
- Se coloca la muestra en tubo citratado.
- Colocar en un vaso de precipitado de  25 ml, 10 ml de solución fisiológica, la muestra de sangre y 0,4 ml de peróxido de hidrógeno.
- Llevar la muestra al hemoactivador, sumergir los electrodos, prender la luz ultravioleta y los electrodos.
- Activar durante 5 minutos.
- Extraer el vaso y observar los cambios físicos - químicos ocurridos: volumen de espuma y color.

B) Análisis epidemiológico de las pruebas diagnósticas:

Evaluación de los resultados arrojados con las técnicas utilizadas, como ser sensibilidad, especificidad, valores predictivos, prevalencia, valor de corte y concordancia de las pruebas diagnósticas. Para la realización del mismo se utilizará el software WinEpi ©2006.
Cronograma de actividades:

Bibliografía:

1. Castillo C., Hernandez,J., Bravo, A., Lopez-Alonso, M., Pereira, V., Benedito, J.L(2005)Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy cows. The Veterinary Journal 169, 286–2921. Castillo C., Hernandez,J., Bravo, A., Lopez-Alonso, M., Pereira, V., Benedito, J.L(2005)Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy cows. The Veterinary Journal 169, 286–292.
2. Lykkesfeldt, Jens y Svendsen, Ove. (2007) Oxidants and antioxidants in disease: Oxidative stress in farm animals. The Veterinary Journal 173; 502–511
3. Sordillo, Lorraine M. y Aitken, Stacey L.(2009). Impact of oxidative stress on the health and immune function of dairy cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology 128; 104–109.
4. Winter, J.L., Barber, L.G.,Freeman, L., Griessmayr,  P.C., Milbury, P.E. and Blumberg, J.B.(2009) Antioxidant Status and Biomarkers of Oxidative Stress in Dogs with Lymphoma. J Vet Intern Med; 23:311–316.
5. Bottari, N. B. , Munhoz, T.D., Torbitz V.D., Tonin A.A., Anai L.A, Semolin L.M.S., Jark, P.C., Bollick,Y.S., Moresco,R.N., França, R.T. , Lopes, S.T.A., Stefani, L.M., Tinucci-Costa, M., Da Silva, A.S.Oxidative stress in dogs with multicentric lymphoma: Effect of chemotherapy on oxidative and antioxidant biomarkers.Redox Report. VOL.20 N°6, 267-274.
6. Estepa, V., Ródenas, S., Martín M.C (2001) Optimización de un método para la determinación de la peroxidación lipídica en suero humano-Anal. Real Acad. Farm., Vol 67 (3).
7. Gerschman, R., Gilbert, D. L., Nye, S. W., Dwyer, P., & Fenn, W.O. (1954). Oxygen poisoning and x- irradiation—A mechanism incommon. Science, 119, 623–626.
8. Harman, D. (1956). Aging—A theory based on free-radical and radiation-chemistry. J. Gerontol., 11, 298–300.
9. McCord, J. M., & Fridovich, I. (1969). Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein Hemocuprein. J. Biol. Chem.,244, 6049–6055.
10. Mittal, C. K., & Murad, F. (1977). Activation of guanylate cyclase by superoxide-dismutase and hydroxyl radical—Physiological regulator of guanosine 3’ ,5’ -monophosphate formation. Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A., 74, 4360–4364.
11. Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., & Mazur, M. (2006).Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem. Biol. Interact., 160, 1–40. 12. Kovacic, P., & Jacintho, J. D. (2001). Mechanisms of carcinogenesis:Focus on oxidative stress and electron transfer. Curr. Med. Chem.,8, 773–796.
13. Ridnour, L. A., Isenberg, J. S., Espey, M. G., Thomas, D. D., Roberts,D. D., & Wink, D. A. (2005). Nitric oxide regulates angiogenesis through a functional switch involving thrombospondin-1. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102, 13147–13152.
14. Valko, M., Morris, H., Mazur, M., Rapta, P., & Bilton, R. F. (2001).Oxygen free radical generating mechanisms in the colon: Do these miquinones of Vitamin K play a role in the etiology of colon cancer? Biochim. Biophys. Acta, 1527, 161–166.
15. Pérez Gastell, Pedro Luis  y Pérez de Alejo, José Luis. (2000). Métodos para medir el daño oxidativo. Rev Cubana Med Milit 29(3):192-8.
16. Dotan, Y., Lichtenberg,D., Pinchuk. I. 2004. Lipid peroxidation cannot be used as a universal criterion of oxidative stress. Progress in Lipid Research 43, 200–227.